细胞β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性比色法定量检测试剂盒
产品说明书(中文版)
主要用途
细胞β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase)活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物PNP-NAG受到β氨基己糖苷酶催化水解后,在碱性环境下,呈现黄色,即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体细胞裂解悬液样品中β氨基己糖苷酶的活性检测。产品严格无菌,即到即用,操作简捷,性能稳定。
技术背景
β氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase;EC3.2.1.52).又称为N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl--β-D-Glucosaminidase;NAGase)属于含有20个糖苷水解酶(glycoside hydrolase)家族,也是肽聚糖水解酶,为溶酶体细胞器中的酶之一。其功能在于水解N-乙酰-β-D-氨基己糖苷中的末端N-乙酰-β-D-氨基己糖残基(N-acetyl-D-hexosamine residues),参与细胞内糖蛋白和糖脂的分解代谢,包括蛋白和中性糖脂中的寡糖、粘多糖等水解。具有宿主抗感染防御作用。β氨基己糖苷酶为同源二聚体结构,有α和β两个亚体构成:HEXA和HEXB。人体缺乏HEXA或HEXB,将导致神经退行性相关的疾病,例如家族黑蒙性病(Tay-Sachs病)和神经节苷脂贮积病 (Sandhoff 病)。 基于底物4-硝基苯基 N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide;PNP-NAG),在β氨基己糖苷酶的作用下,水解释放出硝基苯酚(p-nitrophenol)和N-乙酰-β-D-葡萄糖胺(N-acetyl-β-D-glucosamine;NAG),在碱性环境下,呈现出黄色,在分光光度仪下,产生吸光峰值变化(405nm 波长),来定量分析β氨基己糖苷酶的活性。其反应系统为:
产品内容
缓冲液(Reagent A) 毫升
反应液(Reagent B) 毫升
碱性液(Reagent C) 毫升
阴性液(Reagent D) 微升
清理液(Reagent E) 毫升
裂解液(Reagent F) 毫升
产品说明书 1份
保存方式
保存 反应液(Reagent B)在-20℃冰箱里,避免光照;其余的保存在4℃冰箱里,有效保证6月
用户自备
1.5毫升离心管:用于样品操作的容器
15毫升锥形离心管:用于样品操作的容器
细胞刮脱棒:用于细胞脱离
(微型)台式离心机:用于样品操作
比色皿或96孔板:用于比色分析的容器
分光光度仪或酶标仪:用于比色分析
实验步骤
一、 样品准备
1. 准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞(1至5 X 107细胞)
2. 小心加入xx毫升 清理液(Reagent E),覆盖生长表面
3. 小心抽去清理液
4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞(注意:可以使用胰酶消化)
5. 加入xx毫升 清理液(Reagent E),混匀细胞
6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管(注意:悬浮细胞从这一步骤开始)
7. 放进4℃台式离心机离心5分钟,速度为300g
8. 小心抽去上清液
9. 加入xx微升 裂解液(Reagent F),充分混匀
10. 转移到预冷的1.5毫升离心管
11. 强力涡旋震荡15秒
12. 置于冰槽里孵育30分钟
13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟,速度为16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415)
14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15. 移取10微升进行蛋白定量检测(注意:建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒- 30030.1)
16. 即刻放进-70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1. 准备好待测样品(例如细胞裂解萃取悬液样品等),置于冰槽里
2. 设定好分光光度仪(温度为37℃):波长405nm,并置零
3. 缓冲液(Reagent A)室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1. 移取xx微升 缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入xx微升 反应液(Reagent B)
3. 加入xx微升 阴性液(Reagent D)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在37℃温度下孵育10分钟
6. 加入xx微升 碱性液(Reagent C)
7. 上下倾倒数次,混匀
8. 在37℃温度下孵育5分钟
9. 即刻放进分光光度仪检测,此为背景空对照
四、 样品测定
1. 移取xx微升 缓冲液(Reagent A)到新的比色皿
2. 加入xx微升 反应液(Reagent B)
3. 加入50微升待测样品(50微克蛋白)(注意:样品须清澈,且pH小于7.5)
4. 上下倾倒数次,混匀
5. 在37℃温度下孵育10分钟
6. 加入xx微升 碱性液(Reagent C)
7. 上下倾倒数次,混匀
8. 在37℃温度下孵育5分钟
9. 即刻放进分光光度仪检测,此为样品读数
四、计算样品活性
五、 酶标仪测定
1. 在96孔板上做好相应标记:背景对照和样品
2. 分别移取xx微升 缓冲液(Reagent A)到相应孔里
3. 分别加入xx微升 反应液(Reagent B)
4. 分别加入xx微升 阴性液(Reagent D)或待测样品(20微克蛋白)(注意:样品须清澈,且pH小于7.5)
5. 轻轻摇动96孔板
6. 在37℃温度下孵育10分钟
7. 分别加入xx微升 碱性液(Reagent C)
8. 轻轻摇动96孔板
9. 在37℃温度下孵育5分钟
10. 即刻放进酶标仪检测
11. 活性计算
注意事项
1. 本产品为20次操作,包括背景对照
2. 操作时,须戴手套
3. 系统操作过程中,背景测定只需1次
4. 样品须澄清,至关重要
5. 建议使用比色皿测定
6. 加样后3秒内比色测定
7. 测定值由低到高变化;测定可持续10分钟
8. 比色测定后,比色皿须清洗
9. 样本测定10分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性
10. 建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升;如果样本酶活性过低或过高,则可以增加或降低样本量(本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 30030.1)
11. 如果待测样品浓度过高或过低,可以调整样品浓度
12. β氨基己糖苷酶单位活性定义为:在37℃,pH 4.25条件下,每分钟内能够释放1微摩尔硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位
13. 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品
质量标准
1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感